Am westlichen Rand des Parkes ließ der Kaiser in einem ungenutzten Bereich von dem ebenfalls aus Leiden stammenden Gärtner Adrian van Stekhoven einen regelmäßigen Garten anlegen. Der Garten war in drei Gevierte mit unterschiedlichen Nutzungen geteilt: Obst-, Gemüse- und Blumengarten. Es war eine Kombination aus Küchen- und Botanischem Garten. Im Zentrum jedes Geviertes befand sich ein Springbrunnen. Für wärmeliebende subtropische und tropische Pflanzen (wie Bitterorangen und Ananas) wurden ein großes Treibhaus am nördlichen Rand des Gartens und mehrere Gewächshäuser errichtet. Entlang der östlichen Gartenmauer wurden Obstspaliere gezogen.
Um Pflanzen für diesen Botanischen Garten zu erhalten, beauftragte der Kaiser den Arzt Nikolaus von Jacquin mit einer Forschungsexpedition. Dieser reiste mit Richard van der Schot und zwei Vogelfängern in die Karibik, nach Mittelamerika und in das nördliche Südamerika. Es war der ausdrückliche Auftrag des Kaisers, nur solche Pflanzen mitzubringen, die schöne und wohlriechende Blüten oder essbare Früchte hatten. Außer Pflanzen sammelten Jacquin und van der Schot Tiere für die Menagerie, Muscheln, Versteinerungen, Münzen sowie Gegenstände von ethnographischem Interesse wie Masken, Schmuck und verschiedene kunsthandwerkliche Objekte. Während der Reise sandten die Forscher regelmäßig Kisten mit Samen, Herbarbelegen und lebenden Pflanzen nach Wien. Ein großer Teil dieser Pflanzen war zu dieser Zeit in Europa noch unbekannt. Jacquin kam im Juli 1759 mit einer großen Menge weiterer Kisten wieder in Wien an. Die lebenden Pflanzen wurden in den Gewächshäusern des Schönbrunner Holländisch-Botanischen Gartens und in der Großen Orangerie untergebracht. Die Ergebnisse dieser Forschungsreise publizierte Jacquin 1763 in dem Werk Selectarum stirpium americanarum historia. Die nicht winterharten Pflanzen dieser Expedition wurden in den Glashäusern im Holländisch-Botanischen Garten und im Orangeriegebäude untergebracht.
Bereits 1783 brach erneut eine Forschergruppe im Auftrag des Kaisers zu einer Expedition ins südliche Nordamerika, in die Karibik und nach Mittelamerika auf. Aufgrund eines Kulturfehlers war ein großer Teil der Pflanzen der ersten Expedition in den Glashäusern eingegangen, so dass Ersatz beschafft werden musste. Unter den Expeditionsteilnehmern befanden sich auch die Schönbrunner Gärtner Franz Boos und Franz Bredemayer. Die Expedition dauerte bis 1788, das gesammelte Material wurde in mehreren Lieferungen, zum Teil begleitet von den Gärtnern, nach Wien geschickt.
Von dieser Forschungsreise brachten die Gärtner eine große Zahl winterharter Gehölze mit, für die nun Platz benötigt wurde. 1788 erwarb Kaiser Joseph II. westlich des Tiergartens Land aus dem Eigentum des Stiftes Klosterburg und ließ von Franz Boos diesen neuen Parkbereich als Arboretum anlegen. Bepflanzt wurde es in regelmäßigen Reihen vor allem mit nordamerikanischen Gehölzen, die hier u. a. auf ihre Klimaverträglichkeit getestet werden sollten
In den folgenden Jahrzehnten fanden mehrere grundlegende Umgestaltungen und Veränderungen statt. Für nicht frostharte Pflanzen wurden Glashäuser errichtet, von denen heute noch das Sonnenuhrhaus (Wüstenhaus) und das Große Palmenhaus existieren und als Schauhäuser genutzt werden. Auf der Fläche des ehemaligen Arboretums befindet sich heute noch eine große Anzahl wertvoller nordamerikanischer Gehölze aus der Entstehungszeit dieses Gartens und einige mehrere Hundert Jahre alte Eichen, die in die Gestaltung integriert wurden.
Der Botanische Garten in Schönbrunn ist ein wichtiges, lebendes Zeugnis für die botanisch und gärtnerisch interessierten Mitglieder des Kaiserhauses und ihre Sammelleidenschaft. Darüber hinaus ist es im barocken Schlosspark Schönbrunn der einzige erhaltene landschaftlich gestaltete Bereich.